Rekombinante Proteinkinasen
In Zusammenarbeit mit Carna Biosciences bieten wir > 300 rekombinante Proteinkinasen an, die in verschiedenen Formen hergestellt werden. Profitieren Sie von den Erfahrungen und dem Know-how, das wir in 20 Jahren gesammelt haben.
Rekombinante Proteinkinasen
Kinasen phosphorylieren Moleküle, die komplexe zelluläre Prozesse wie Wachstum, Proliferation, Differenzierung, Motilität und Apoptose steuern. Unter pathologischen Bedingungen kann die Kinaseaktivität dysreguliert werden, und die Störung der von diesen Enzymen gesteuerten intrazellulären Signalnetzwerke führt zu vielen Krankheiten wie Entzündungen und Krebs. Infolgedessen sind Kinaseinhibitoren, die die Wirkung pathologisch dysregulierter Kinasen blockieren, zu einem wichtigen Ziel für die Arzneimittelforschung geworden.
Rekombinante Proteinkinasen werden mit Hilfe der rekombinanten DNA-Technologie hergestellt, bei der DNA-Sequenzen, die für die betreffende Kinase kodieren, geklont und in einer Wirtszelle, z. B. in Bakterien oder Säugetierzellen, exprimiert werden. Auf diese Weise können große Mengen an reiner Proteinkinase hergestellt werden, die dann für verschiedene Forschungsanwendungen, wie z. B. die Entdeckung von Arzneimitteln und die Untersuchung der Kinaseaktivität, verwendet werden können.
Rekombinante Proteinkinasen werden häufig in der Arzneimittelforschung eingesetzt, um niedermolekulare Verbindungen auf ihre Fähigkeit zu untersuchen, die Kinaseaktivität zu hemmen oder zu aktivieren, was für die Entwicklung von Therapien, die auf Kinasen ausgerichtet sind, wichtig ist. Sie werden auch in biochemischen Versuchen zur Untersuchung von Kinase-Signalwegen und Protein-Protein-Wechselwirkungen eingesetzt.
In Zusammenarbeit mit Carna Biosciences bieten wir > 300 rekombinante Proteinkinasen an, die in verschiedenen Formen hergestellt werden, darunter Proteine in voller Länge oder verkürzte Formen, die nur die katalytische Domäne enthalten. Alle Produkte werden von der Genklonierung über die Expression bis hin zur Reinigung vollständig intern entwickelt und hergestellt und unterliegen einer strengen Qualitätskontrolle. Jedes Kinasekonstrukt wird sorgfältig aus der Literatur ausgewählt, und die DNA-Sequenz wird vor der Expression bestätigt.
Rekombinante Proteinkinasen können so verändert werden, dass sie spezifische Modifikationen wie Mutationen oder Markierungen enthalten, die ihre Aktivität und Stabilität verändern oder eine leichtere Reinigung ermöglichen. Zur Aktivierung der Kinasen werden verschiedene Methoden eingesetzt, wie die Koexpression mit einer vorgeschalteten Kinase, ATP-Behandlung, Dephosphorylierung oder die Entfernung von Markierungen. Wir werden die verschiedenen Methoden hier näher erläutern:
Aktivierung von rekombinanten Proteinkinasen
Vorinkubation mit ATP
Viele Rezeptor-Tyrosin- und andere Kinasen, die in Zellen exprimiert werden, werden durch Stimulation mit Agonisten aktiviert. Die Isolierung von Membranproteinen aus unseren Kinase-Expressionssystemen ist jedoch nicht einfach. Stattdessen exprimieren wir nur die intrazelluläre Domäne der Rezeptor-Tyrosin-Kinase und inkubieren sie dann in Gegenwart von ATP, um die Autophosphorylierung zu fördern. Dies führt dazu, dass die Kinase vollständig phosphoryliert wird und ihre Aktivität nach der Reinigung steigt.
Verwendung von Upstream-Kinasen
Zur Herstellung von Kinasen, die an einer Phosphorylierungskaskade beteiligt sind (eine Abfolge von Signalweg-Ereignissen, bei denen ein Enzym durch vorgeschaltete Kinasen phosphoryliert wird, wie z. B. die MAPK-Kaskade), verwenden wir ein Insektenzell-Koexpressionssystem mit der gewünschten Kinase und einer vorgeschalteten Kinase. Wir reinigen dann auf der Grundlage von Tag-Unterschieden, um eine aktivierte Zielkinase zu erhalten. Eine alternative, einfachere Methode besteht darin, eine gereinigte Zielkinase mit einer vorgeschalteten Kinase in Gegenwart von ATP zu inkubieren und sie dann erneut zu reinigen, um die vorgeschaltete Kinase zu entfernen, was zu einer aktiven Form der Kinase von Interesse führt.
Protease-Spaltung des Expressions-Tags
Die künstliche Herstellung rekombinanter Proteinkinasen birgt das Risiko einer Inaktivierung der Kinaseaktivität. Im Allgemeinen verwendet Carna bevorzugt einen GST-Tag zur Expression von Kinasen. Da es sich bei GST um ein 26kDa-Protein handelt, das dimerisieren kann, ist es schwierig zu sagen, dass dieses Tag keine Auswirkungen auf die Aktivität des Proteins hat. Als eine Lösung bauen wir eine PreScission Protease (cytiva) Spaltstelle in unsere GST-Fusionskinasen ein. Die Entfernung des GST-Tags aus dem Protein kann die Aktivität einiger Kinasen erhöhen, wie am Beispiel unserer TSSK-Kinase unten gezeigt wird.
Dephosphorylierung
GSK3 ist ein Beispiel für eine rekombinante Proteinkinase, bei der die Phosphorylierung bestimmter Stellen eher zu einer geringeren als zu einer höheren Kinaseaktivität führt. Insbesondere wurde berichtet, dass die Phosphorylierung von Ser21 (GSK3a) oder Ser9 (GSK3b) zur Inaktivierung der Kinase führt. Durch eine enzymatische Behandlung mit Phosphatase kann die GSK3-Aktivität wiederhergestellt werden.
Wir verwenden einen für jede spezifische Kinase optimierten Ansatz, der es uns ermöglicht, Enzyme von höchster Qualität zu liefern. Die Qualitätskontrolle umfasst die Bestätigung der Aminosäuresequenz durch Peptide Mass Fingerprinting, die Überprüfung der Reinheit durch SDS-PAGE, die Bestimmung der Konzentration mittels Bradford und die Bestimmung der Aktivität unter Verwendung von Substraten aus der umfangreichen Substratbibliothek von Carna.
Warum sollten Sie sich für die Kinasen von Carna entscheiden?
Unsere rekombinanten Proteinkinasen zeichnen sich dadurch aus, dass sie keine Lag-Phase-Aktivität aufweisen, GST-markiert oder biotinyliert (DYKDDDDK-markiert) sind, in Größen von 5 µg bis hin zu Bulk-Mengen erhältlich sind und von Charge zu Charge konsistent sind. Alle Produkte werden vollständig im eigenen Haus entwickelt und hergestellt, unterliegen einer strengen Qualitätskontrolle und werden mit einem chargenspezifischen Datenblatt geliefert. Profitieren Sie von den Erfahrungen und dem Know-how, das wir in 20 Jahren gesammelt haben.
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